低溫肉制品是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等熱加工過程使肉制品的中心溫度控制在68~72 ℃,并且需要在0~4 ℃的低溫環境下貯藏、運輸及銷售的一類肉制品。與高溫肉制品(通常采用121 ℃、0.1 MPa的高溫高壓加熱方式)相比,低溫肉制品能夠最大限度地保留肉類原有的營養成分及風味物質,是世界肉類產品的發展趨勢。低溫肉制品在蒸煮階段一般采用68~72 ℃的殺菌工藝,冷卻后在無菌車間進行切分,真空包裝為此類肉制品的主要包裝形式,保質期一般為2~4 周,保質期的長短主要取決于初始菌量及貯藏溫度。
本研究對真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進行菌株的培養、分離與純化以及PCR擴增,通過擴增核糖體DNA限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA),并對菌株的生理生化特性進行研究,為進一步采取有效的防腐保鮮措施、延長產品的貨架期提供參考。
1、菌株的菌落特征及PCR鑒定結果
本研究分別采用涂布法和傾注法對菌株進行培養,根據樣品稀釋液在BHI培養基上所生長細菌菌落的表型差異,共篩選出12 株腐敗菌,編號為n01~n12,12 株菌的基本形態特征如表1所示。菌株的分離和篩選主要依據其形態、顏色等特征,不排除篩選出同一種屬、甚至同一菌株的可能性。
所有菌株經過PCR擴增(16S rDNA)后均出現了清晰可辯的特異性條帶,條帶大小為1 500 bp左右。其中菌株n01、n04、n05、n09、n10的PCR擴增結果如圖1所示。
2、ARDRA結果
ARDRA是限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)在核糖體DNA序列上的應用。最初的RFLP技術的依據是不同生物個體之間DNA片段的酶切位點有所差異,經限制性內切酶消化后能夠產生長短、種類、數目不同的限制性片段,基于對限制性片段的分析,從DNA水平比較不同個體之間的差異。ARDRA則是根據16S rDNA基因序列的限制性片段區分菌株種的差異。
12 株菌的16S rDNA分別經EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切、TaqⅠ單酶切后,均可獲得便于區分的酶切圖譜。根據條帶的相似性可以將12 株菌分為5 組,第1組包括n01、n02、n03和n08,第2組包括n05、n06和n07,第3組包括n09和n11,第4組包括n10和n12,第5組僅包括n04。同一組內菌株的酶切圖譜具有較高的相似性,表明這些菌株之間存在一定的親緣關系。
3、菌株系統進化樹的構建
n01和n08與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、n02與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、n03與特基拉桿菌(Bacillus tequilensis)親緣關系最近,它們均屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.);n04與嗜冷桿菌屬(Psychrobactersp.)親緣關系最近;n05、n06和n07與魏斯氏菌屬(Weissellasp.)親緣關系最近;n09和n11與鏈球菌屬(Streptococcussp.)親緣關系最近;n10和n12與腸球菌屬(Enterococcussp.)親緣關系最近。
4、菌株的生理生化鑒定結果
參照GenBank比對結果,根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行相應的生理生化鑒定。由表2可知,n01和n08為枯草芽孢桿菌,n02為解淀粉芽孢桿菌,n03為特基拉芽孢桿菌,n04為嗜冷桿菌屬的Psychrobacter urativorans(暫無中文命名),n05、n06和n07為魏斯氏菌屬中的綠色魏斯氏菌,n09和n11為巴黎鏈球菌,n10和n12為糞腸球菌。
結論
本研究對真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進行分離,并結合表型分析、ARDRA、系統進化樹的構建對菌株進行鑒定。結果表明,分離得到的12 株菌中,4 株為芽孢桿菌屬,3 株為綠色魏斯氏菌,2 株為巴黎鏈球菌,2 株為糞腸球菌,1 株為嗜冷桿菌。其中,綠色魏斯氏菌是導致樣品變綠的主要原因,總體來說,乳酸菌是真空包裝低溫熟肉制品中的主要腐敗菌。本研究為進一步采取有效的防腐保鮮措施、延長低溫肉制品的貨架期提供了理論依據。